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新医学时代治疗性基因组编辑

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摘要：

1901年，阿奇博尔德·加洛德爵士鉴定出已知的第一种人体遗传疾病尿黑酸尿症。今天我们认识到，至少有8 000种人体疾病是由单个基因突变引起的，称为单基因病，其数目几乎每天都在增加。这些疾病在美国被分类为“罕见病”，因为它们的受累人群都少于20万人，而在全球范围它们则可能累及4亿人口。一些疾病，如镰刀细胞病，全球累及数千万人口，而在世界的特定区域它只能分类为“罕见”，包括美国、欧洲和亚洲的远东地区。对于少数病人，同种异体造血干细胞移植（allo-HSCT）或者实体器官移植可用来治愈其遗传性疾病；对于绝大多数病人来说，没有治疗手段，最多进行一些症状管理。

使用基因组编辑治疗单基因病从概念上来说是简单的——基因组编辑可以用来纠正致病的基因组“排版印刷”错误。基因组编辑的力量在于，它可以提供一种机制来做比简单修饰单个核苷酸更多的事情。它是一种可以制造更复杂而细微的基因组改变的方法，可以被用来治疗更为常见的疾病或修饰它们的成因。这篇综述将介绍基因组编辑的基本战略和工具，它们既可以拿来纠正印刷错误也可以对基因组做出更为复杂的改变。还将讨论基因组编辑是如何被研发用以治疗遗传性疾病、传染性疾病和获得性疾病的。最后，简要讨论围绕基因组编辑应用的技术问题：从可能导致工程化遗传改变到可能从一代传到下一代。

基因组编辑工具箱

基因组编辑又称为基因打靶，是科学家手中一种强有力的研究工具。基因打靶在酵母中很容易进行，酵母即成为研究人体病理生理学的一种重要模式生物体。基因打靶作为一种研究工具，其重要性进一步彰显，在于2007年诺贝尔生理学或医学奖授予了奥利弗·史密斯和马里奥·卡佩奇博士，以表彰他们对小鼠胚胎干细胞基因打靶的发展及对小鼠的后续精准遗传工程研究。这是人体病理生理学领域的转折性进步。在基因治疗（研究）的最早期，人们就认识到基因组编辑可以成为治愈遗传疾病的理想方法，但是最早的研究中，通过在人体体细胞内进行同源重组来进行基因纠正的绝对频率低下（10-6），让人们颇感困惑。关键的突破是发现了在靶基因内构建一种位点特异性DNA双链折断（DSB），有可能通过同源重组刺激基因组编辑提升2～5个数量级，提供出5%或更多的总体频率。除了通过同源重组刺激基因打靶可以提高5个数量级，一种位点特异性DSB可能刺激突变，比如引起DSB位点上的微小插入/缺失提高达9个数量级。正因为如此，DSB被认定为基因组编辑研发中一个关键的原则。

基于核酸酶的基因组编辑基本过程是在基因组内构建一个位点特异性DSB，然后催动细胞自己的内源性修复机制来修复折断（图1）。细胞可以使用两种基本机理来修复折断：非同源性末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）。当单个折断的编辑因NHEJ而发生，就可以在折断位点上构建出插入/缺失之类的突变（图1a）。缺失的尺寸趋向于大于插入的尺寸，当染色体外DNA在折断位点处被捕捉时例外（其发生率罕见但是可测量），这种时候可以发生数百碱基对的插入。当使用捐赠者的供体序列进行HR而发生单个折断的编辑时，会发生基因组内的精准核苷酸改变，从单个碱基长度的插入到大型基因盒的导入。当两个折断的编辑通过NHEJ而发生时，染色体缺失、倒转或易位可以得到构建（图1b）。这些总体染色体重排可以有针对性地生成以供治疗用，但是它们还必须得到评价，因为任何核酸酶平台都有产生脱靶效应的潜能。

图1.基于核酸酶的基因组编辑在基因组内构建了一种特异性双链折断（DSB），然后形成细胞自己的内源性修复机制来修复这种折断

在证明了DSBs重要性的研究论文中，研究人员使用了一种人工系统，在其内的天然归巢核酸内切酶（有时也称为“大范围核酸酶”）的靶位点ISceI被工程化进入了体细胞的基因组内；基因组编辑的频率可以在该工程化的 I-SceI位点得到测度。高频率编辑的障碍是，不论是I-SceI还是其他大范围核酸酶都不能轻易地再工程化以识别基因组内的天然靶部位。这个问题的第一种解决方法是已经建立了的锌指核酸酶（ZFNs），最初称为“嵌合体限制酶”，后来被称为“嵌合体核酸酶”。ZFNs是一类人工蛋白质，其一种锌指DNA结合结构域与衍生自IIS型FokI限制性核酸酶的非特异性核酸内切酶结构域发生了融合。首先，在刺激人类体细胞内基因打靶方面，工程化ZFNs被证明与I-SceI一样有效。然后，因为锌指DNA结合结构域可以被工程化以识别新的靶位点，基于ZFN的方案成为第一种用来刺激人类体细胞内基因组编辑的方法，其（编辑）频率可达到治疗相关水平。与这项人类体细胞内的研究工作相提并论的重要工作是德纳·卡罗尔（Dana Carroll）及其同事们证明了ZFNs可以被用来编辑真核生物黑腹果蝇的复杂基因组，使用突变原性NHEJ和同源重组方法均可。多年以来，硕果仅存的工程化核酸酶，在基因组编辑工具箱内来说是ZFNs和再工程化大范围核酸酶。但是，在过去5年中，TAL效应物核酸酶（TALENs）、CRISPR/ Cas9核酸酶和杂交核酸酶平台的研发与构建已经戏剧性地扩展了工程化核酸酶工具箱。